【วัตถุประสงค์การใช้งาน】

ชุดทดสอบนี้เป็น PCR เรืองแสงแบบเรียลไทม์ของ TaqMan เพื่อตรวจวัดคุณภาพ ORF1ab, กรดนิวคลีอิกของยีน N ของ 2019-nCoV ในไม้กวาดเช็ดลำคอ, เสมหะในผู้ป่วยที่สงสัยว่ามีอาการปอดบวมและกรณีคลัสเตอร์

ผลการทดสอบมีไว้เพื่อการอ้างอิงทางคลินิกเท่านั้น และไม่สามารถถือเป็นเกณฑ์มาตรฐานสำหรับการวินิจฉัยทางคลินิกเท่านั้น ขอแนะนำให้ทำการวิเคราะห์โดยชัดแจ้งเกี่ยวกับอาการทางคลินิกและผลการตรวจทางห้องปฏิบัติการอื่นๆ

ผู้ปฏิบัติงานควรมีประสบการณ์การฝึกอบรมวิชาชีพในการขยายยีนหรือการทดสอบวิธีอณูชีววิทยา และมีคุณสมบัติที่เกี่ยวข้องสำหรับการปฏิบัติงานในห้องปฏิบัติการ ห้องปฏิบัติการควรมีข้อควรระวังด้านความปลอดภัยทางชีวภาพและขั้นตอนการป้องกันที่เหมาะสม

【หลักการทดสอบ】

ในชุดอุปกรณ์นี้ ไพรเมอร์และโพรบได้รับการออกแบบสำหรับพื้นที่อนุรักษ์และบริเวณเฉพาะของ ORF1ab, N ของ 2019-nCoV ตามลำดับ Fluorescent PCR ใช้ในการตรวจจับ RNA ของไวรัสหลังจากการทำให้กรดนิวคลีอิกบริสุทธิ์ของตัวอย่าง RNA

ชุดทดสอบนี้ใช้เทคโนโลยี PCR เรืองแสงแบบเรียลไทม์ ในระหว่างการขยาย PCR โพรบจะเชื่อมโยงกับเทมเพลต และกลุ่มผู้รายงาน 5'-end ของโพรบจะถูกแยกออกโดยเอนไซม์ Taq (กิจกรรม exonuclease 5'→3') ด้วยเหตุนี้ เคลื่อนออกจากกลุ่มดับเพื่อสร้างสัญญาณฟลูออเรสเซนต์ กราฟการขยายแบบเรียลไทม์จะถูกพล็อตโดยอัตโนมัติตามสัญญาณเรืองแสงที่ตรวจพบ และค่า Ct ของตัวอย่างจะถูกคำนวณ (จำนวนรอบที่พบเมื่อสัญญาณเรืองแสงในหลอดปฏิกิริยาแต่ละหลอดถึงเกณฑ์ที่ตัดสิน) ฟลูออโรฟอร์สีแดงของ FAM ,VIC และ Texas ถูกนำมาใช้เพื่อทำเครื่องหมายยีน ORF1ab และโพรบยีน N ในสารละลายปฏิกิริยา ด้วยการใช้การทดสอบเพียงครั้งเดียว จึงสามารถทำการตรวจหายีนทั้งสองข้างต้นของเชื้อ 2019-nCoV ในเชิงคุณภาพได้พร้อมกัน

เพื่อหลีกเลี่ยงผลลัพธ์ที่เป็นลบลวง ชุดอุปกรณ์จึงมีระบบควบคุมภายใน (IC) ซึ่งมีเครื่องหมายกลุ่มฟลูออเรสเซนต์ Cy5 ซึ่งสามารถใช้เพื่อตรวจสอบขั้นตอนการสกัดและสารละลายปฏิกิริยา

【ส่วนประกอบหลัก】

หมายเหตุ¹ : ส่วนประกอบต่าง ๆ ไม่สามารถแลกเปลี่ยนได้

หมายเหตุ² : ชุดทดสอบไม่มีรีเอเจนต์สกัดกรดนิวคลีอิก โปรดเตรียมรีเอเจนต์ก่อนใช้งาน

1. การจัดการตัวอย่าง

เพิ่ม 10μL ของการควบคุมภายในลงใน 200μL ของการควบคุมเชิงบวกและการควบคุมเชิงลบ ตามลำดับเพื่อดำเนินการสกัดกรดนิวคลีอิก

2. การเตรียมรีเอเจนต์:

การเตรียมระบบ: นำไลโอฟิไลเซอร์สำหรับขยายกรดนิวคลีอิกที่ติดตั้งไว้ล่วงหน้า จากนั้นเปิดถุงฟอยล์แล้วปั่นแยกทันที จำนวนตัวอย่างของการทดสอบแต่ละครั้งควรเป็นทวีคูณของ 8 โดยมีกลุ่มควบคุมเชิงบวกหนึ่งกลุ่มและกลุ่มควบคุมเชิงลบหนึ่งกลุ่ม เติมน้ำที่ปราศจากนิวคลีเอส 35μL ลงบนหลอดปฏิกิริยาแต่ละหลอด

3. การโหลดตัวอย่าง:

เติมกรดนิวคลีอิกตัวอย่าง5μLที่จะทดสอบ การควบคุมเชิงบวก การควบคุมเชิงลบว่าปริมาตรปฏิกิริยาทั้งหมดคือ 40 μL ในสารละลายปฏิกิริยาที่จัดสรร เพราะมันไม่จำเป็นต้องใช้ส่วนผสมที่ละเอียด และเพียงปิดฝาของหลอดปฏิกิริยา PCR แล้วหมุนเหวี่ยง ของเหลวในผนังท่อที่ด้านล่างของท่อ จึงประมวลผลการขยาย PCR

หลังจากการตรวจสอบแล้ว คาดว่าการเติมน้ำมันพาราฟิน 5μL-10μL ในระบบ PCR จะไม่ส่งผลต่อผลลัพธ์ PCR แต่หลีกเลี่ยงการปนเปื้อนและการทำให้ของเหลวกลายเป็นไอ